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CAR-T疗效关键点:CAR-T细胞杀伤活力评估方法——EuTDA 时间分辨荧光检测

版权所有,转载请联系基因市场部
2018-07-25

对于CAR-T开发者来说,除了选择合适的肿瘤抗原很重要以外,如何增强CAR-T细胞的增殖活性和杀伤活性也是多年来的一个研究重点。这期就来总结一下提高CAR-T活性的研究都有哪些。

CAR-T 的发展历史主要是围绕增强活性为主。CAR-T 1.0CAR-T 3.0的变化主要体现在了CAR的胞内信号区。CAR-T 1.0只用CD3ζ信号链上的酪氨酸序列作为“信号1”来激活T细胞。而CAR-T 3.0则是在信号1的基础上加上了两个共刺激信号CD28CD137,这不仅使其分裂活性获得提升,还促进了IL-2的合成与表达和抗凋亡蛋白Bcl-xL的分泌,从而抵消肿瘤细胞微环境带来的不利影响,但不影响其抗原特异性。

1CAR结构发展过程

 

Nature Reviews上面的一篇综述就总结了一些能提高CAR-T效果的方法。

2 [1]:改善CAR-T治疗效果的方法总结。 a. 武装CAR-T细胞:T细胞不仅表达CAR,还会分泌IL-2来抵抗肿瘤微环境的抑制。b. 双受体CAR: 双受体CAR-T包含了识别肿瘤细胞抗原的CAR和把肿瘤细胞分泌的细胞因子转化成活化信号的CAR. c. 自然杀伤细胞(Natural killer cells, NK细胞)受体CAR: NK细胞的受体,如NKG2-D,整合到抗原识别域,可增强CAR-T细胞对正常细胞和肿瘤细胞的分辨能力。d. 阻断免疫检查点:来自于肿瘤微环境的免疫检查点信号PD-1或者CTLA4会对T细胞活性造成抑制作用。通过利用这两者的受体抗体就可以阻断其配体-受体的结合,削弱对T细胞的抑制。 e. 改善T细胞持久性:由于机体会对CAR衍生的外源多肽产生免疫反应,最终导致改造的免疫细胞的破坏。通过向胰腺癌病人回输两种不同靶向的CAR T细胞(一种识别CD19,一种识别mesothelin),其中CD19-CAR用来清除B细胞,从而阻止破坏mesothelin-CAR抗体的产生,最终改善CAR T细胞持久性。f. 靶向肿瘤血管细胞:血管生成素,如VEGF,会导致肿瘤的恶化与迁移。一些肿瘤基质细胞或者肿瘤细胞会大量表达VEGFR-2。一些临床前的研究表明,靶向VEGFR-2CAR T可有效去除肿瘤基质细胞,但不会对正常细胞有影响。

 

可以看出,如何提高CAR-T增殖活性和杀伤力将继续是研究工作者们的一个重要主题。那通常评价CAR-T细胞的活性和杀伤力的方法都有哪些呢?

 

免疫细胞 (Effector) 对肿瘤细胞 (Target) 杀伤活性评价

免疫细胞肿瘤杀伤活性的体外评价过程都涉及到免疫细胞 (Effector) 和肿瘤细胞 (Target) 两种细胞存在,因此不能采取传统的细胞增殖活性检测手段 ( MTTATP 等方法) 直接进行检测。需要采用其他标记手段。

 

1. EuTDA 时间分辨荧光检测

EuTDA Cytotoxicity的检测原理与同位素 51Cr 释放的方法相似,通过特异性乙酰酯化的荧光探针BATDA标记 Target 肿瘤细胞,酯化的BATDA可穿透细胞膜随后被活细胞内的乙酰酯酶去乙酰化,去乙酰化的TDA 不能再次透过细胞膜而滞留的细胞内。然后洗涤离心去除多余染料,加入 Effector  免疫细胞,裂解后的 Target 肿瘤细胞将 TDA 释放到上清中,与时间分辨荧光探针 Eu 结合形成 Eu-TDA 复合物,最终通过检测该复合物的时间分辨荧光信号评价免疫细胞杀伤活性。

3BATDA 检测原理图

 

该方法具有更高的检测灵敏度,操作性、安全性及数据稳定性等方面也更有优势。EuTDA Cytotoxicity检测方法已被广泛应用于细胞杀伤活性评价,目前已有近千篇学术论文采用该检测方法。

 

评价CAR T细胞增殖活性

1. 免疫细胞代谢活性 (ATP 含量) 化学发光检测

ATP(三磷酸腺苷)是细胞活性的标志物,其仅存在于具有代谢活性的细胞内。由于萤光素酶和其底物 D-luciferin 反应需要ATP的存在才能产生光信号,其产生的化学发光信号同 ATP 含量成正比,因此可以通过检测发光强度反映细胞的代谢活性。PerkinElmerATPLite试剂盒是基于这个反应来达到高灵敏地检测细胞活性(最低 5 个细胞/孔),线性范围可达 5 个数量级,操作步骤简单,且信号稳定。无论是从灵敏度还是实验操作,都优于传统的MTT/XTT方法。

 

4生物发光反应

 

5ATPlite 1 step实验操作流程

 

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参考文献:

 [1] Jackson, Hollie J., Sarwish Rafiq, and Renier J. Brentjens. "Driving CAR T-cells forward." Nature reviews Clinical oncology 13.6 (2016): 370.

 


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