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转录组学研究

 转录组学研究简单来说即从RNA水平研究基因表达的情况。以DNA为模版合成RNA的转录过程是基因表达的第一步,也是基因表达调控的关键步骤,在不同条件下或处理方法不时同,基因的表达随之千变万化,研究转录组谱可提供不同条件下基因的表达信息,并据此相应基因功能,进而揭示调节基因的作用机制。

转录组谱研究内容广泛,如差异基因表达、选择性可变剪切等,其中差异基因根据是否最终可被翻译成蛋白质可分为mRNA和非编码RNA,后者根据RNA的长度不同又分为miRNA、siRNA、rRNA、tRNA、snoRNA、lncRNA等等,这些分子在RNA水平就能行使各自的生物学功能。

 转录学研究方法多种,但应用高通量芯片技术是一种快捷可靠的获取转录组信息的方法。下图是转录学研究的经典路线:



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我司采用Affymetrix表达谱芯片为广大研究工作者提供多方位转录谱研究,更有高级、个性化数据分析为研究添砖加瓦,在后续验证工作中,采用Quanti-Gene bDNA技术对中低通量基因的表达水平进行后续实验验证。


  • 全转录组芯片服务之Clariom D Solution——转录组水平解决方案

    仅限HumanMouse and Rat


    该系列具有前所未有的全面转录组覆盖,提供更深、更广、更精细的转录组信息检测,适用于不同来源与性质的样品,包含临床来源的样品,是转化研究的首选工具。仅通过一次实验,便可准确检测编码 RNA 与非编码 RNA 在基因水平、外显子水平的表达差异以及丰富全面的可变剪切信息。Clariom D Solution 为加速生物标记物探索与发现而设计,能够以最快速度获取可执行的结果,带来全面的覆盖率、稳定的可重复性、深度可执行的 RNA 标记物。


    快速准确的从 15 个数据库超过 540,000 个转录本中发现鉴定疾病相关标记物

     

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    精心独特的探针设计可信赖的从编码
    RNA、非编码RNA 中检测基因水平、外显子水平及可变剪切信息

    检测其它技术方法无法检测的低丰度和极低丰度转录本3.jpg

     

    此外,苜蓿作为豆科植物研究的模式生物,Affymetrix亦推出设计理念如Clariom D系列的对应产品——GeneChip@ Medicago Transcriptome Array

    GeneChip® Medicago transcriptome solution


          可检测的物种亚型丰富

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          覆盖度高


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  • 全转录组芯片服务之Clariom S Solution——基因水平解决方案

    仅限Human、Mouse and Rat


    为科研工作者提供快速、便捷以及灵活的方式去检测转录组内的基因水平变化。特别设计针对覆盖所有注释明确的基因,兼容不同类型样品包含临床来源样品,多种格式包含单张卡式芯片及高通量板式芯片,以满足不同样品通量研究需要。Clariom S Solution 是研究注释明确基因的最好工具—简单、高速、低成本。


    准确检测覆盖超过 20,000 个注释明确基因的基因水平表达及信号通路变化,极速获取结果


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    针对基因转录本保守序列精心设计探针提供真实基因水平信息

     

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    按需选择合适格式满足不同样品通量研究需要,可每天处理 1 192 个样品(新推出板式芯片)


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  • 全转录组芯片服务——Human Transcriptome Array 2.0 and其他物种类型

           模式生物来研究生物学问题的重要性不言而喻,我司采用Affymetrix st系列芯片为您提供相应表达谱分析服务。

    芯片特点

          这些模式和应用研究生物芯片提供了全转录组覆盖,每个设计都是基于最新的转录组数据库信息,提供了最高的探针覆盖度 ( 全 长基因平均有 25 个探针 ),实现了全转录组水平表达变化的准确检测,且分辨率和准确性高于市场上其他传统的 3' 端表达谱芯 片。全转录组分析方法让研究人员能够检测特定基因的多个转录本异构体,包括 3' 端检测方法可能错过的转录本,如可变剪切、 非 PolyA 转录本、多 PolyA 位点转录本以及截短的转录本。

    物种类型

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  • 3’IVT芯片服务

    GeneChip® PrimeViewTM 人类基因表达芯片

          PrimeViewTM 人类基因表达芯片以卡式芯片 (Cartridge) 形式提供了高质量的基因表达分析技术,实现了全基因组的基因表达分 析。PrimeViewTM 芯片表现出极高的性能,检测信号强以及重复样品的倍数变化关联性好;它是一款研究药物和疾病调控机制 的强大且经济高效的工具。

    芯片特点

    1.  提供了出色的基因表达检测的特异性和可重复性

    2. 通过每个转录本的多次独立检测产生可靠的结果注释明确的序列为每组11个探针,其余的每组9个探针

    3. 提供了已注释基因组的完整覆盖—行业中最高的转录本覆盖度,覆盖Refseq中所有注释明确的基因和转录本

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    芯片内容

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    其他物种类型的3’IVT芯片

     


    物种

    产品

    内容

    动物

    小鼠

    GeneChip® Mouse Genome 430 2.0 Array

    >39,000转录本

    大鼠

    GeneChip® Rat Genome 430 2.0 Array

    >30,000转录本

    疟原虫/按蚊

    GeneChip® Plasmodium/Anopheles Genome Array

    22,348探针组:

         5407(p.falciparum)

         16,941(A.gambiae)

    GeneChip® Bovine Genome Array

    >23,000转录本

    线虫

    GeneChip® BC.elegans Genome Array

    >22,500转录本

    GeneChip® Canine Genome 2.0 Array

    >18,000 EST和mRNA转录本

    >20,000预测基因

    GeneChip® Chicken Genome Array

    32,773鸡转录本684个禽类病毒转录本(含17种禽类病毒)

    果蝇

    GeneChip® Drosophila Genome 2.0 Array

    >18,500转录本

    恒河猴

    GeneChip® Rhesus Macaque Genome Array

    >47,000转录本

    GeneChip® Porcine Genome Array

    23,256转录本

    非洲爪蟾

    GeneChip® Xenopus laevis Genome 2.0 Array

    >29,900转录本

    热带爪蟾

    GeneChip® Xenopus tropicalis Genome Array

    >51,000转录本

    斑马鱼

    GeneChip® Zebrafish Genome Array

    >14,900转录本

    植物

    拟南芥

    GeneChip® Arabidopsis Genome ATH1 Array

    >24,000转录本

    大麦

    GeneChip® Barley Genome Array

    >22,500探针组

    柑橘

    GeneChip® Citrus Genome Array

    -30,171 Citrus 探针组

    -5023 SNP 探针组

    -7 Citruscontrol 探针组

    -2 Citrus tiling 探针组

    -46 Citruspathogen 探针组

    棉花

    GeneChip® Cotton Genome Array

    21,854转录本

    葡萄

    GeneChip® Vitis viniferaGrape Genome Array

    >15,700转录本

    玉米

    GeneChip® Maize Genome Array

    >14,850转录本

    苜蓿/中华根瘤菌

    GeneChip® Medicago Genome Array

    61,200探针组,含M.truncatula、M.sativa和S.meliloti

    杨树

    GeneChip® Poplar Genome Array

    >56,000转录本

    植物

    水稻

    GeneChip® Rice Genome Array

    48,564粳稻(Japonica)转录本

    1,260籼稻(Indica)转录本

    大豆

    GeneChip® Soybean Genome Array

    58,463转录本

    -G.max 35,611

    -P.sojae 15,421

    -H.glycines 7,431

    甘蔗

    GeneChip® Sugar Cane Genome Array

    >7,500转录本

    番茄

    GeneChip® Tomato Genome Array

    >9,254转录本

    小麦

    GeneChip® Wheat Genome Array

    >55,000转录本

    微生物

    大肠杆菌

    GeneChip® E.coli Genome 2.0 Array

    20,366个基因

    E.coli Antisense Genome Array

    4,200个ORF

    >1,350基因间序列

    绿脓杆菌

    GeneChip® P.aeruginosa Genome Array

    -PAO1 strain的5,500   ORF

    -100基因间序列

    -其他菌株的117歌基因

    金黄色葡萄球菌

    GeneChip® S.aureus Genome Array

    -3,300 ORF

    -4,800基因间序列

    酵母

    <p style="margin-bottom:16px;li
  • 表达谱芯片送样要求及数据分析、报告内容

    一、 样本量要求

    总RNA:提供浓度不低于50 ng/ul,总量不小于2 μg的总RNA,OD260/280在1.7-2.1范围内,28s和18s双带清晰可见。(请标明浓度和体积!)

    细胞:细胞样本一般要求提供≥ 5×106个细胞数/ 张芯片样品

    组织:应确保组织可以抽提出10μg的总RNA。

    血液:提供大于5ml血液样本,确保纯化出不小于10ug的RNA

    具体送样要求详见

     附件1:AFFY 芯片服务客户须知 V2016.docx


    二、实验流程

    3’IVT芯片实验流程全转录本WT芯片实验流程
    1. 总RNA纯化1. 总RNA纯化
    2. cDNA合成、cRNA 的生物素标记及cRNA 片段化2. cDNA合成、ss-DNA的片段化及生物素标记
    3. 基因芯片杂交反应、扫描3. 基因芯片杂交反应、扫描
    4. 数据处理和结果报告4. 数据处理和结果报告


     三、 数据分析流程

    图片 1.png 

     

    四、报告内容

    3’IVT芯片服务实验报告内容:

    原始数据CEL文件、芯片扫描原始图像
    质检报告RNA样本质检报告、芯片质检报告
    数据分析结果RMA data:提供所有探针RMA均一化后的信号值及相应数据库注释等信息
    芯片两两比较或组间比较的结果:提供全部探针组在两样品中的表达变化的方向及程度和数据库注释等信息,并筛选出变化两倍以上的探针组
    小提琴图:为各芯片整体信号值相对分布图
    散点图或散点矩阵图:用于评估两组数据总体分布集中趋势
    主成分分析图:生物学重复样本提供所有芯片表达模式相似性分析,并绘图
    火山图(optional):展示所有基因在倍数差异(Fold change)与P值分布上的特点,该分析需用户设置重复样本
    热图(optional):用于显示不同组间基因表达水平,该分析需用户设置重复样本
    GSEA数据分析:根据Broad Insititute网站公布的Gene Set进行分析,不设定阈值,全局分析重要生物学通路,该分析需要设定重复样本
    富集分析:基于筛选出的差异基因进行GO和Pathway富集分析
    参考资料芯片数据解读说明性文件及实验流程等   


    全转录本WT芯片服务实验报告内容:

    原始数据CEL文件、芯片扫描原始图像
    质检报告RNA样本质检报告、芯片质检报告
    数据分析结果RMA data:提供所有探针RMA均一化后的信号值及相应数据库注释等信息
    芯片两两比较或组间比较的结果:提供全部探针组在两样品中的表达变化的方向及程度和数据库注释等信息,并筛选出变化两倍以上的探针组
    小提琴图:为各芯片整体信号值相对分布图
    散点图或散点矩阵图:用于评估两组数据总体分布集中趋势
    主成分分析图:生物学重复样本提供所有芯片表达模式相似性分析,并绘图
    火山图(optional):展示所有基因在倍数差异(Fold change)与P值分布上的特点,该分析需用户设置重复样本
    热图(optional):用于显示不同组间基因表达水平,该分析需用户设置重复样本
    可变剪接分析(optional):计算所有可变剪接潜在位点发生可变剪接的可能性,该分析需用户设置重复样本。注:只有Clariom D solution及HTA2.0芯片可提供
    lncRNA cis调控:列出lncRNA上下游500kb范围内可能与之存在调控关系的mRNA。注:只有Clariom D solution及HTA2.0芯片可提供
    GSEA数据分析:根据Broad Insititute网站公布的Gene Set进行分析,不设定阈值,全局分析重要生物学通路,该分析需要设定重复样本
    富集分析:基于筛选出的差异基因进行GO和Pathway富集分析
    参考资料芯片数据解读说明性文件及实验流程等

    详细结果形式及更多高级数据分析了参见附件2: 基因芯片服务数据分析手册


  • 基于bDNA技术的QG/QGP服务

            Affymetrix公司旗下的Panomics开发出的Branch-DNA(bDNA)技术是一种独特的三明治结构核酸杂交方法,该方法采用 bDNA 分子放大技术用于捕获的目标 RNA 信号。使用QuantiGene产品,根据用户选择的基因定制探针,单重或多重定量分析基因表达水平及DNA拷贝数变化,也是基因芯片/NGS测序数据以及转化研究中验证生物标志物的理想工具。我司将该技术与Luminex平台相结合,为广大研究工作者提供核酸分析服务。

    技术特点

    •    No miRNA, RNA and DNA isolation (无需抽提)

    •    No reverse transcription (无需反转录)              

    •    No PCR amplification (无需PCR扩增)

    •    高达8000倍的信号放大,有效避免酶反应带来的偏差

    •    真正的多重定量——每孔可检测多达80个指标而无交叉反应

    •    应用广泛,可检测不同类型目标分子及样本类型:mRNA, miRNA, ncRNA, DNA copy number, in situ, FFPE, blood......

    技术服务

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    1.     多基因检测服务——QuantiGene® Plex 2.0系列产品

     服务特点

    -    同一反应检测高达80种基因

    -    标准化平台——96孔板形式与Luminex100相结合

    -    庞大的已验证基因探针库——超过15,000个基因的探针库,可任意挑选混合,亦可定制探针

     

    2. 单基因检测服务——QuantiGene® 2.0系列产品


    ①    裂解样本,释放出目标RNA

    ②    加入探针组:捕获延伸探针的一部分与孔板底部结合,另一部分与目标RNA结合。“ZZ”型标记延伸探针与目标RNA结合,另外,封闭探针用于封闭一些位点提高特异性

    ③    加入信号放大前提、放大体、碱性磷酸酶标记的探针和底物

    ④    分光光度计检测

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    另,还可以检测miRNA的表达亮变化情况,探针设计原理见下图: 

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    探针特点:

    •    敏感度——>3,000 miRNA copies/assay well

    •    特异性——One base

    •    探针长度——25-mer;less,if miRNA length is less than 25


    QG 2.0QG Plex
    每孔检测1种miRNA/RNA/DNA分子每孔可检测3-80种mRNA/3-34种DNA分子
    主要应用领域:生物标志物的检测、siRNA敲除定量、DNA拷贝数分析、miRNA定量、基因融合检测主要应用领域:生物标志物、信号通路分析、DNA拷贝数变异、芯片和测序结果验证
    检测平台:分光光度计检测平台:Luminex 100   

       

    样本要求


    总RNA/DNA:提供量不小于1ug

    细胞:细胞样本一般要求提供≥ 1×105 个细胞数/样品

    FFPE切片:每个样品约需切片面积250px2×5um厚度

    血液:提供500ulEDTA或柠檬酸抗凝血液样本,-80度冻存/新鲜抗凝血液样本


    服务流程


    1.样品裂解
    2.探针标记的beads与样品杂交
    3.洗涤染色,结果读取
    4.数据处理和结果报告


    检测报告

    1.   检测的原始数据:提供各探针检测数据。
    2.   样品相对定量结果:提供探针相对标准品的相对定量结果信息。
    3.   QC Report文件:Luminex公司XPONENT3.1软件给出的报告文件。
  • miRNA芯片服务


            众所周知,miRNA的研究在过去几年中发展相当迅速,我司采用Affymetrix最新开发的GeneChip® miRNA 4.0 Array为广大客户提供优质服务。

    芯片特点

    1.     100%覆盖全新miRBase 20数据库

    芯片内容


    miRBase

    Release 20

    Ensembl(BioMart   Export)

    Release 73

    snoRNAbase

    Version 3

    mirTarbase

    Release 4.5

     

    2.    物种涵盖广—可同时检测203个物种的miRNA表达变化

    3.     样本需求量低—仅需130ng的Total RNA

    4.     可检测miRNA类型广、数量多(下表仅列出人、大小鼠)

    种类

    Human

    Mouse

    Rat

    成熟miRNA

    2578

    1908

    728

    pre-miRNA

    2025

    1225

    490

    SnoRNA 、ScaRNA

    1996

    0

    0

     服务流

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    样本要求

    总RNA:针对细胞来源样本,提供浓度不低于500 ng/ul;针对组织来源样本,提供浓度不低于100 ng/ul。总量均不可小于2 μg的总RNA,OD260/280在1.7-2.1范围内,28s和18s双带清晰可见。(请标明浓度和体积!)

    细胞:细胞样本一般要求提供1×107个细胞数/ 张芯片样品

    组织:应确保组织可以抽提出10μg的总RNA

    血液:提供大于5ml血液样本,确保纯化出不小于10ugRNA

    数据分析

    数据归一化及差异表达分析与mRNA芯片一致,下面仅介绍miRNA独特的几项数据分析内容

    1.  miRNA靶基因信号通路富集分析

         该分析展示用于差异miRNA的靶基因在所有Pathway中的分布趋势,首先求得每个miRNA的靶基因,之后再统计这些靶基因在所有260多个Pathway中的位点分布情况,分箱(binned)后绘制热图,其中每一行代表一条miRNA,每一列代表Pathway,热图可以全面的展示这些miRNA的调控功能主要集中在哪些Pathway中,方便您将非编码RNA与编码RNA关联起来研究。

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    2.  miRNA靶基因预测分析

          对于miRBase 20中新收入的miRNA,目前尚无数据库收录其对应靶基因信息,对于这类miRNA,可提供De Novo靶点预测分析服务。该预测算法整合miRanda与TargetScan算法的优点:

    *    miRNA与吧序列结合的2D简图,特别重要的互补区域以彩色标识出来

    *    结合点周围的AU含量,AU越多,该区域越容易打开,利于AGO-miRNA复合物结合

    *    在UTR区域的相对位置,越靠近两端,越可能是有效位点

    *    是否满足TargetScan及miRanda算法的检出阈值

    *    结合区域的序列保守性

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        结合区域的序列保守性 

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    3. 内源竞争性RNAceRNA)网络分析

          mRNA与lncRNA质检可以通过共享相同种类的miRNA分子,在大量重要的生物学通路中,都有ceRNA参与维护系统的稳定。

           下图右侧是我司提供的ceRNA网络分析示例图,展示出mRNA(绿色)/lncRNA(蓝色)竞争结合miRNA的关系图。

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