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激光显微切割技术在植物空间组学研究中的应用

版权所有,转载请联系基因市场部
2020-11-17




激光显微切割技术在植物空间组学研究中的应用

学术分享|作者:基因市场部


    植物的生长和发育在很大程度上取决于组织和(或)器官特异表达的基因,但要获取某一发育阶段的特异细胞类型来进行基因表达分析又是相当困难的。激光显微切割技术可以在显微镜下快速准确地找到单一的细胞类群,甚至单个细胞, 通过激光显微切割成功地获取纯的单一类型细胞,以此作为下游的基因组测序、转录组测序、表达谱芯片、蛋白组学等深度分析的起始材料,避免了组织中细胞的异质性问题,同时还能够保留细胞的原始的空间位置信息。基于激光显微切割的空间转录组技术在植物的基因表达分析、植物生殖和胚胎发育研究、代谢物分析以及植物与微生物互作等方面均具有重要的应用价值。


基于激光显微切割技术的空间组学研究思路

1.基于激光显微切割技术从复杂组织中分离获得特异性的细胞类群

2.从分离的均质细胞中提取生物大分子(DNA、RNA、miR、Protein)并做质控

3.组织&细胞水平上的组学分析


案例一、空间转录组分析鉴定与细胞特异性以及大麦发育过程中胚乳细胞化有关的不同基因组

    该文中作者使用MMI CellCut Plus激光显微切割系统对开花后3天的大麦籽粒组织冰冻切片进行合胞体和胚乳转移细胞的切割和收集,每份样本切割收集30-40 sections,使用Agilent nanoprep kit进行RNA纯化,线性扩增制备cDNA文库,后续通过RNA-Seq的方法进行转录组测序,qRT-PCR对RNA-Seq结果进一步验证。

A图:合胞胚乳细胞化时大麦籽粒的中间横切面

B图:开花后3天大麦籽粒的冰冻切片图,绿色圈内指示ETC胚乳转移细胞;紫色圈内指示胚乳液泡周围的合胞体

C图:放大图右边显示切割下来的胚乳转移细胞

D图:电泳图显示RNA完整性较好


  上图展示激光显微切割来源的大麦籽粒组织RNA-Seq数据质量(base call accuracy >99.9%;Mapped  

 reads %>83%; Hits HC genes%>58%)

                                                                         

激光显微切割获得的大麦籽粒组织扩增和未扩增/参考样品的RNA序列产生的标准化log 2转化表达值的相关性和可重复性。A图热图显示样本之间的皮尔森相关系数。颜色饱和度对应于相关级别(浅黄色-弱相关,红色-最高相关)。B图由IVT产生的ETC和Sync组织的独立生物学重复显示出0.96和0.97之间的高度相关性。C图D图扩增样本和非扩增样本之间的相关系数介于0.88至0.91之间,表明扩增程序对推断的转录本丰度影响较小。

通过qRT-PCR分析验证RNA-seq数据。通过qRT-PCR评估了通过RNA-seq分析得到的ETC和Sync之间的差异表达基因(DEG)子集的表达。转录本比率显示qRT-PCR与RNA-seq数据之间的高度一致性,证实了基于激光显微切割分离大麦组织RNA-seq分析数据的可靠性。


   基于激光显微技术的空间转录组分析,适合于多种谷物植物多器官如分生组织、花器官等的组织特异性转录组分析,能够产生高度可信和重复性的数据。

案例二、提供基于激光显微切割方法进行植物花中卵细胞切割后用于RNA-Seq的protocol

MMI Cell Cut Plus激光显微切割系统切割大叶红杉卵细胞。A和C图为切割前大叶红杉成熟配子体7μm切片。B和D图为卵细胞被切割后。(egg cell: e, synergids: s, central cell: cc)


与无融合生殖细胞和性成熟配子体细胞或无融合生殖细胞相比,仅在无融合卵卵细胞中表达的基因的鉴定。236个基因在无融合卵卵细胞中高表达,但在B. gunnisoniana的无融合性中枢7细胞,协同增生细胞或无融合性初始细胞中,或在拟南芥的成熟有性配子体细胞中均无表达。


    激光显微切割技术可以以非常高的时间和空间分辨率进行发育过程等的分析,解析单一细胞类型转录组甚至细胞亚结构,适用于拟南芥、十字花科植物等多物种多组织。该文提供了详细的组织制备、激光显微切割、RNA提取以及质控等的步骤和注意事项,为在分子水平上理解发育过程提供了方法学上的依据。

    德国MMI厂家的CellCut Plus从复杂组织或细胞群中获得感兴趣的单一类型细胞或单细胞,为单细胞的研究创造必要的先决条件。无需将组织解离成单个细胞而丢失空间位置信息,可保留细胞结构。极高的收集效率以及低损伤切割保证下游测序等结果高的样本质量。真正实现“”what you see is what you get”,以极高的空间分辨率应用于空间转录组、空间基因组、蛋白组等组学分析。

    基因有限公司作为一家专业性的生命科学仪器、试剂供应商,自1992年成立以来一直秉承着“基因燃亮生命 生物技术连接世界”的宗旨,力求将先进的技术方法推荐到国内,为广大客户提供包括技术咨询、产品选配、售后培训及维护的专业服务体系,并作为MMI全国性代理商,可为感兴趣的客户提供专业的产品咨询、技术答疑及联系试用等,欢迎大家前来咨询。


文献引用:


 1.Ronny Brandt et al., Laser Capture Microdissection-Based   RNA-Seq of Barley Grain Tissues.Methods in Molecular Biology, vol. 1723.2018

2.Ana Marcela FlorezRueda,etal. Laser-assisted Microdissection(LAM) as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types. 2016

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