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叮咚!请查收您的ChIP实验优化指南,内有惊喜

版权所有,转载请联系基因市场部
2021-05-12

做ChIP实验染色质制备的时候总是遇到染色质片段化不好、重复性不好、IP后得到的量过少?

下面两图是两个不同用户最近新鲜出炉分享给我们的染色质超声片段化电泳结果,都是用Covaris truChIP超声试剂盒+Covaris 超声进行第一次ChIP实验超声时间梯度摸索。两图都可以看到明显的时间梯度打断,超声2min即可达到绝大部分片段在150-750bp。

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 可见使用Covaris truChIP超声试剂盒+Covaris超声,仅需1-2次时间梯度摸索即可得到稳定的超声条件,易优化可重复,低SDS配方,节约3倍抗体花费,低温超声保护抗原表位,提高IP效率!

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现在备受用户好评的Covaris truChIP超声优化试剂盒真诚回馈了!Covaris ChIP试剂盒活动价仅需1890 (50rxn),购买还赠双重惊喜好礼!

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下面附上ChIP实验优化指南,送给各位实验汪们,指南在手,结果说有就有!



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ChIP实验优化指南


      ChIP即染色质免疫共沉淀技术,是研究蛋白质-DNA相互作用的常用实验技术,在表观遗传学和转录因子调控研究中被广泛应用。ChIP实验繁琐复杂,任何一个环节的失误都会导致整个实验的失败。ChIP实验的各种优化方案也是层出不穷。今天为大家总结一些独家ChIP实验优化秘籍,帮助各位挣扎在ChIP上的实验汪们早日脱离苦海。

我们先来看下ChIP实验流程:


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ChIP实验是一个研究蛋白质和DNA相互作用的实验,因此,在这个实验中有三件事情,是最重要的:

01

要维持蛋白质和DNA手拉手的状态(固定交联要恰当)

02

抗体要能够成功识别蛋白质(抗原表位要保护好)

03

DNA的检测--下游PCR和测序要能成功(染色质片段化要均一彻底)

ChIP实验的条件是一定要进行优化的,下面我们来看看哪些部分需要着重优化和注意的呢?


固定试剂以及固定时间


01

固定试剂的选择别忽略

固定用的甲醛试剂常常被忽略。很多实验室常用的37%甲醛其实并不适合用于ChIP实验固定细胞和组织。

首先37%甲醛溶液含有甲醇:甲醇起到稳定剂的作用,可以防止氧化和甲醛缩聚,但是甲醇存在的情况下,更容易有较大分子量的染色质产生,而这些染色质不容易被打断,需要加大超声时间去打断或完全打不断,但其实这样做即使打断了也已经破坏了抗原表位。

其次37%甲醛是多聚甲醛,多聚甲醛会形成不同的多聚体,每种多聚体的固定效率不同,造成每次的细胞固定差异导致重复性的降低。用粉末状的多聚甲醛配制固定液也同样不推荐。

推荐大家使用16%单体甲醛溶液(ChIP级别),仅含有甲醛单体,无复合物,可以提供最好的、最准确的固定结果。最推荐的是即开即用的小支包装,如CST的12606S。

02

建议进行甲醛固定时间的优化

绝大部分实验汪们固定的时间太久了,固定不仅与细胞系相关,甚至于蛋白抗原表位也相关。固定时间过长不仅会使蛋白质-DNA聚合物过于紧密,导致片段化困难、解交联困难,还会导致蛋白空间结构变化,损伤抗原表位,使得抗体难以成功识别结合。当然固定时间也不要过短。

不是所有的细胞都以同样的速率得到固定,因此针对不同的细胞和组织,对固定和打断时间进行梯度实验就非常重要,建议在优化实验时,用western blot 检查蛋白表位的完整性。

另外传统的水浴和探针超声法使用超高超声能量打断染色质,因此为了减少该过程对染色质的损伤,这些方案一般会要求延长甲醛固定时间(≥10min)。

相对来说Covaris的高频短波长聚焦超声((Adaptive Focused Acoustics ,AFA),是轻柔的聚焦超声打断法,效率更高,因而样本无需长时间固定,一般我们建议干细胞和原代细胞固定时间2.5和5分钟,其他细胞类型固定5分钟和10分钟。如果关注转录因子,则建议固定时间10min。


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图1.相同细胞不同固定时间(0-2-5-10-15-20min)在相同超声条件下所产生的染色质片段。

*圆圈所指部位是固定过度(20min)后产生的片段化困难的大分子聚合物。

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图2. 随着固定时间的增长,蛋白对IgG的非特异性结合显著升高


Shearing buffer中的SDS浓度


一般水浴超声和探头超声打断的ChIP protocol,往往是一步法细胞裂解和染色质片段化同时进行,这需要使用含高浓度去垢剂(1%甚至更高)的超声打断buffer,同时需要高超声能量。

但是高浓度的SDS对抗原表位的损伤很显著。抗原表位负责与抗体结合,对免疫共沉淀的成功至关重要。因而在IP前,往往需要进行10倍以上稀释,再加入抗体进行IP。这也增加了抗体的消耗。此外一步法的产率一般会显著少于两步法(先裂解细胞,再破核进行染色质打断)。

另外一种Covaris AFA聚焦超声,由于其聚焦超声能量利用率高、温控好,且采用两步法进行优化,因而可以支持低浓度SDS浓度(0.1%)的超声打断buffer,可以直接进行下游IP,无需稀释,提高产率的同时,也节约了抗体成本

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图3. 随着shearing buffer中SDS浓度的升高,ChIP的富集倍数显著降低。


染色质片段化时间优化


不是片段化越彻底,结果就会越好。分布紧密的DNA碎片看起来赏心悦目,上面结合的蛋白却很有可能已经遭受表位受损。使用温控不好的片段化仪器,生物大分子分分钟降解;即使是优秀的温控仪器,长时间的剪切力也会对抗原表位造成损伤。请在抗原表位和染色质片段化效果中找到一个平衡,以达到最佳的实验效果。因而我们建议需要进行超声打断梯度摸索优化实验。特别推荐在片段化后使用ChIP抗体对抗原表位进行验证,在条件摸索阶段尽可能监控更多的步骤,提高实验成功率。

下面是两种传统染色质超声片段化方法的比较,建议选用更好的超声片段化仪器进行片段化。保证ChIP实验样本制备的质量,以免影响后期实验。

水浴超声

● 缺少超声能量控制;

● 超声能量不聚焦,大部分能量转换为热能,缺少温控,损伤蛋白抗原表位;

● 需要多次优化条件;

● 需要高浓度SDS剪切buffer;

● 需要高超声能量,易损伤染色质,因而往往需较长甲醛固定时间来减少染色质损伤;

● 超声换能器功能衰减;

探头超声

 高温金属探针插入样本,损伤蛋白抗原表位;

● 样本与样本的打断结果差别较大;

 难处理微量样本;

● 需要高浓度SDS剪切buffer;

● 需要高超声能量,易损伤染色质,因而往往需较长甲醛固定时间来减少染色质损伤;

● 探头易造成样本间交叉污染;

● 噪音大;


因而针对以上这些ChIP 样本处理优化,我们推荐使用Covaris AFA聚焦超声和truChIP超声试剂盒解决方案。

为什么是推荐Covaris?

Covaris采用高频率短波长的医用级别超声波,超声能量强,作用彻底。与所有传统的基于超声的样本处理方法不同,Covaris采用聚焦超声技术,仪器与样本不进行接触,球型换能器产生超声聚焦作用于样本,能量利用率极高,方向和力度精准可控处理重复性好。仪器功率低,效率好,整个系统无过多热能,温控良好

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Covaris ChIP解决方案优势

优势

 易优化并通用的protocol:Covaris全套解决方案将摸索时间缩短至1-2周;

● 高重复性:AFA精确控制,系统稳定,完成条件摸索后即可稳定的得到好的结果;

● 良好的温控:AFA等温处理,保护蛋白抗原表位,提高免疫沉淀和DNA的回收率;

● 超低起始量:FFPE样本、稀少珍贵的细胞组织做ChIP也可保障简便高效、高得率;

● 优良剪切效果:Covaris片段化重复性、剪切无偏好、片段长度分布精确可控;

 低SDS剪切可选SDS或非离子剪切缓冲液,SDS用量仅为常规方法1/10,减少SDS对IP过程中抗体的影响,无需进行样品稀释直接用于下游IP,提高IP效率。

基因有限公司作为Covaris公司中国的合作伙伴和全国代理商,为您提供DNA 片段化、ChIP实验、FFPE样本核酸提取、蛋白提取解决方案等。基因有限公司的宗旨是“专才为专家服务”,有专业团队为各大科研机构提供安装培训,技术支持,应用培训与售后维护一条龙服务,赢得客户的一致好评与信任。想要了解更多,请关注我们的官方微信“基因快讯”或联系您身边的基因有限公司员工。


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